综合前两期的“满满的干货（一）”和“满满的干货（二）”，大家对于质粒DNA的提取应该会有一定程度的了解，那么在使用过程中，很多人觉得自己提取的质粒效果还是很差，究竟是怎么回事呢？
本期给大家在准备了一些质粒DNA提取时需要注意的事项，这些结果包含了浓度偏高或低的原因及解决方案：
原因及解决方案
01质粒浓度偏高
存在RNA残留：未完全消化RNA（RNase A失效或未添加），导致A260值虚高。
解决方案
提取前一定要在溶液Ⅰ中加入RNase A，如果已加完RNase A的溶液Ⅰ在冰箱放置久了，一定要补加RNase A。
02细菌培养状态不佳
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细菌密度过低：若细菌培养液OD值（如OD600）未达到对数生长期后期（通常1.0-1.5），菌体数量不足，会直接导致质粒总量减少。
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培养时间过长：超过对数生长期后，细菌进入稳定期或衰退期，可能释放核酸酶降解质粒，同时菌体裂解难度增加。
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细菌污染，若培养液中混入杂菌，杂菌会争夺营养，导致目标细菌生长受抑，同时可能释放酶类破坏质粒。
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菌液长期存放。
解决方案
（1）调整培养时间至12-16小时，但避免过度生长导致质粒丢失。
（2）确保使用合适的培养基（如LB）和正确的抗生素浓度。
（3）接种前用新鲜活化的单菌落，避免使用陈旧或多次传代的菌液。
03质粒拷贝数低
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某些质粒（如大质粒或低拷贝质粒）天然拷贝数低（如pBR322为低拷贝）。
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插入片段过大（>10kb）导致复制效率下降。
解决方案
（1）选择高拷贝质粒载体。
（2）若需保留低拷贝质粒，可增加培养体积（如从5mL增至10-20mL），提高质粒总量。
04质粒降解
在提取过程中，如果操作环境存在核酸酶（如DNase、RNase），或者提取过程中剧烈震荡、温度变化过大等，可能会导致质粒降解，使提取的质粒浓度降低。
解决方案
（1）在提取过程中，使用无核酸酶的试剂和耗材，如无核酸酶的水、无核酸酶的离心管等。
（2）操作时动作要轻柔，避免剧烈震荡。严格控制温度，尤其是在裂解和洗脱等关键步骤。
原因及解决方案
05裂解不充分
菌液量过多。
碱裂解（Solution II）时间过短：无法彻底破坏细菌细胞膜和释放质粒；时间过长（超过5分钟）：会导致基因组DNA断裂并与质粒共沉淀，同时强碱可能降解质粒。
裂解液未混匀。
解决方案
（1）采用适量的菌液量进行提取。
（2）确保充分裂解，但时间不要超过5分钟。
（3）加完Solution II一定要轻柔且充分混匀。
06中和与离心不彻底
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Solution III未充分混匀，质粒复性不完全；
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离心转速/时间不足（如<12,000rpm或<10分钟），沉淀未分离。
解决方案
（1）加入Solution III后，立即颠倒混匀8-10次，直至出现均匀白色絮状沉淀。
（2）12,000-13,000rpm离心10-15分钟，确保沉淀完全。
07洗脱液使用不当
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洗脱液体积过大。
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洗脱液pH不合适。
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洗脱温度不足：未将洗脱液预热至60℃左右，低温会降低质粒从硅胶膜上的解离效率。
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加完洗脱液未静置直接离心。
解决方案
（1）洗脱时调整洗脱液添加体积，洗脱液体积过大会稀释浓度；体积过小则无法充分湿润硅胶膜，导致质粒洗脱不完全。
（2）洗脱液（ddH2O或TE缓冲液）pH偏酸性（<7.0）会降低质粒溶解度，影响洗脱效率，建议pH8.0-8.5。
（3）洗脱液加入后需静置1-2分钟，质粒充分溶解并释放后再离心。
08操作损耗
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离心后上清未完全吸弃，稀释菌体。
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重悬缓冲液（Solution I）未充分混匀，菌体沉淀未分散。
解决方案
（1）菌体离心后，用移液器彻底吸尽上清（残留量<10μL）。
（2）加入Solution I后，用涡旋仪或移液器反复吹打至沉淀完全分散（无可见颗粒）。
索莱宝质粒提取试剂盒产品列表
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货号 |
名称 |
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D1100 |
质粒小量提取试剂盒 |
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D1110 |
质粒大量提取试剂盒 |
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D1120 |
革兰氏阳性菌质粒小量提取试剂盒 |
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D1130 |
革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒 |
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D1140 |
去内毒素质粒小量提取试剂盒 |
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D1150 |
去内毒素质粒大量提取试剂盒 |
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D1160 |
酵母质粒小量提取试剂盒 |
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DM1100 |
质粒小量提取试剂盒（磁珠法） |